Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection Kit

Cat No. 40302

產(chǎn)品說明書

本產(chǎn)品僅作科研用途！

產(chǎn)品信息

產(chǎn)品描述

Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection Kit）是用 FITC 標(biāo)記了的 Annexin V 作為探針，來檢測細(xì)胞早期凋亡的發(fā)生，可用熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀或其他熒光檢測設(shè)備進(jìn)行檢測。

其檢測原理為：在正常的活細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸（phosphotidylserine，PS）位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在早期凋亡的細(xì)胞中，PS 從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。Annexin-Ⅴ（膜聯(lián)蛋白-V）是一種分子量為 35-36KD 的 Ca²⁺ 依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS 高親和力結(jié)合?？赏ㄟ^細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合。

另外，本試劑盒中還提供了碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）用來區(qū)分存活的早期細(xì)胞和壞死或晚期凋亡細(xì)胞。PI 是一種核酸染料，它不能透過正常細(xì)胞或早期凋亡細(xì)胞的完整的細(xì)胞膜，但可以透過凋亡晚期和壞死細(xì)胞的細(xì)胞膜而使細(xì)胞核染紅。因此，將 Annexin V 與 PI 聯(lián)合使用時，PI 則被排除在活細(xì)胞（Annexin V-/PI-）和早期凋亡細(xì)胞（Annexin V+/PI-） 之外，而晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞同時被 FITC  和PI  結(jié)合染色呈現(xiàn)雙陽性（Annexin V+/PI+）。

產(chǎn)品組分

編號 組分

產(chǎn)品編號/規(guī)格

運(yùn)輸與保存方法

冰袋（wet ice）運(yùn)輸。本試劑盒中所有組分均在 4℃保存，勿凍存。Annexin V-FITC、PI 需避光保存。一年有效。

注意事項

1) 由于細(xì)胞凋亡是一個快速的過程，建議樣品在染色后 1 小時之內(nèi)進(jìn)行分析。

• 對于貼壁細(xì)胞，消化是一個關(guān)鍵步驟。貼壁細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡時如有漂浮細(xì)胞，需收集漂浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞后合并染色。處理貼壁細(xì)胞時要小心操作，盡量避免人為的損傷細(xì)胞。胰酶消化時間過短，細(xì)胞需要用力吹打才能脫落，容易造成細(xì)胞膜的損傷，PI 攝入過多；消化時間過長，細(xì)胞膜同樣易造成損傷，甚至?xí)绊懠?xì)胞膜上磷脂酰絲氨酸與 Annexin V-FITC 的結(jié)合。消化時將胰酶鋪滿孔板底后，輕搖時胰酶與細(xì)胞充分接觸，然后倒掉大部分胰酶，利用剩余的少量胰酶再消化一段時間，待細(xì)胞間空隙增大，瓶底呈花斑狀即可終止。在消化液中盡量不用 EDTA，EDTA 會影響 Annexin

V 與PS 的結(jié)合。

3) 實(shí)驗中如需要固定細(xì)胞，比如在檢測凋亡的同時檢測細(xì)胞周期，只能選用Annexin V-FITC，而不能選用Annexin V-EGFP，因為在固定過程中 EGFP 會變性導(dǎo)致喪失激發(fā)熒光的能力。固定前需要先將細(xì)胞與 Annexin V-FITC 進(jìn)行孵育，并用binding buffer 洗掉未結(jié)合的 Annexin V-FITC。因為固定過程中細(xì)胞通透性增加會產(chǎn)生細(xì)胞碎片，可以和 Annexin V 結(jié)合，對結(jié)果產(chǎn)生干擾。

4) 如果樣品來源于血液，請務(wù)必除去血液中的血小板。因為血小板含有 PS，能與 Annexin  V 結(jié)合，從而干擾實(shí)驗結(jié)果。可以使用含有 EDTA 的緩沖劑并在 200 g 離心洗去血小板。

5) 試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋內(nèi)壁上的液體甩至管底，避免開蓋時液體灑落。

6) Annexin V-FITC 和PI 是光敏物質(zhì)，在操作時請注意避光。

操作方法

1.1 樣品染色

1. 懸浮細(xì)胞：300g，4℃離心 5 min 收集細(xì)胞。貼壁細(xì)胞：用不含 EDTA 的胰酶消化后，300g，4℃離心 5 min 收集細(xì)胞。胰酶消化時間不宜過長，以防引起假陽性。

2. 用預(yù)冷的PBS 洗滌細(xì)胞 2 次，每次均需 300g，4℃離心 5 min。收集 1～5×10 ⁵ 細(xì)胞。

3. 加入 100μl 1×Binding Buffer 重懸細(xì)胞。

4. 加入 5μl Annexin V-FITC 和 5μl PI Staining Solution，輕輕混勻。

5. 避光、室溫反應(yīng) 10 min。

6.  加入 400μl 1×Binding Buffer，混勻，樣品在 1 小時內(nèi)用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡檢測。注：為了避免洗滌細(xì)胞時損失細(xì)胞，在吸液時可以用大的 Tip 頭套上小的 Tip 頭吸液。

1.2 樣品分析

A. 流式細(xì)胞儀分析：

FITC 大激發(fā)波長為 488 nm，大發(fā)射波長 525 nm，FITC 的綠色熒光在 FL1 通道檢測；PI-DNA 復(fù)合物的大激發(fā)波長為 535 nm，大發(fā)射波長為 615 nm，PI 的紅色熒光在 FL2 或FL3 通道檢測。用 CellQuest 等軟件進(jìn)行分析，繪制雙色散點(diǎn)圖（two-color dot plot），FITC 為橫坐標(biāo)，PI 為縱坐標(biāo)。每個樣采集 10，000 events。典型的實(shí)驗中，細(xì)胞可以分成三個亞群，活細(xì)胞僅有很低強(qiáng)度的背景熒光，早期凋亡細(xì)胞僅有較強(qiáng)的綠色熒光，晚期凋亡細(xì)胞有綠色和紅色熒光雙重染色。

B. 熒光顯微鏡分析：

1) 滴一滴用 Annexin V-FITC/PI 雙染的細(xì)胞懸液于載玻片上，并用蓋玻片蓋上細(xì)胞。注：對于貼壁細(xì)胞，可直接用蓋玻片培養(yǎng)細(xì)胞并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

2) 在熒光顯微鏡下用雙色濾光片觀察。Annexin V-FITC 熒光信號呈綠色，PI 熒光信號呈紅色。

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