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pUC-T TA快速連接試劑盒（含載體，連接酶）說明書
pUC-T Quick Ligation Kit
pUC-T TA快速連接試劑盒（含載體，連接酶）
目錄號(hào)：YJ2591
保存條件：-20℃保存。
組分說明
Cat. No. YJ2591
Size 20次
pUC-T（50 ng/μl） 20 μl
Conctrol Insert (50 ng/μl) 10 μl
Quick T4 DNA Ligase 20 μl
2×Quick Ligation Reaction Buffer 120 μl
本產(chǎn)品僅供科研使用，請(qǐng)勿用于臨床診斷及其他用途
產(chǎn)品簡介
pUC-T TA載體是一種克隆PCR產(chǎn)物的載體，它是由pUC18載體在EcoR V
酶切位點(diǎn)處切開，在兩側(cè)的3′端添加T而成。由于大部分耐熱聚合酶反應(yīng)時(shí)都會(huì)在 PCR
產(chǎn)物的3′端添加一個(gè)A，它可以與pUC-T 3′端的T互補(bǔ)連接，因此可大大提高PCR產(chǎn)物的連接和克隆效率。
試劑盒中配備率的T4 DNA Ligase和為快速DNA連接優(yōu)化的2×Quick Ligation
Reaction Buffer。連接效率相當(dāng)于用T4 DNA Ligase 進(jìn)行常規(guī)連接1小時(shí)。帶有插入片
段的重組子可根據(jù)α互補(bǔ)原理，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，判斷載體中有無外源基因的插入?？?/SPAN>
隆后可以用BcaBEST Sequencing Primers和 M13通用引物對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序。
注意事項(xiàng)
1．Insert DNA 要求
1）連接使用的PCR片段3’末端應(yīng)帶有“A"尾。有些高保真DNA聚合酶，如我公司的 Pfu擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物是平滑末端，可使用加A試劑盒加上A尾后，再進(jìn)行T載體克隆。
2）PCR產(chǎn)物建議進(jìn)行切膠回收純化后再進(jìn)行T載體克隆，以免PCR產(chǎn)物中的非特異片
段或殘存引物等雜質(zhì)影響。推薦使用 YJ2302/YJ0524/YJ0518 快速瓊脂糖凝膠
DNA回收試劑盒。
2．連接反應(yīng)要求
1）本試劑盒能使大多數(shù)連接反應(yīng)在25℃條件下5分鐘甚至更短時(shí)間內(nèi)達(dá)到反應(yīng)終點(diǎn)，
增加反應(yīng)時(shí)間反應(yīng)效率不會(huì)增強(qiáng)。如用快速連接反應(yīng) 1小時(shí)后，轉(zhuǎn)化效率會(huì)明顯降
低；如25℃快速連接反應(yīng)過液夜，則轉(zhuǎn)化效率會(huì)下降到75%。
2）2×Quick Ligation Reaction Buffer含有ATP，使用前置于冰上使其融化后充分混
勻，建議初次使用分裝成小管凍存，避免其反復(fù)凍融影響DNA連接效率。
3）由于T4 DNA Ligase中含有甘油，比較粘稠容易掛壁，建議使用之前短暫離心將
液體收集到管底，取樣時(shí)槍頭盡量不要深入液面太深，以免粘在槍頭上造成損失。
4）如快速連接產(chǎn)物用于電轉(zhuǎn)，因快速連接反應(yīng)體系中的PEG會(huì)影響電轉(zhuǎn)效率，建議
使用離心柱將連接產(chǎn)物進(jìn)行DNA純化（如YJ2301快速DNA產(chǎn)物純化試劑盒）后再
進(jìn)行電轉(zhuǎn)。
3．感受態(tài)細(xì)胞要求
建議使用的熱擊轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，這樣才可能得到比較理想的陽性克隆，如需
進(jìn)行藍(lán)白篩選，宿主細(xì)胞必須具有正確的基因型（F′編碼的【lacZ ΔM15】）產(chǎn)生ω片
段，才能與載體DNA產(chǎn)生的LacZ α多肽結(jié)合，表現(xiàn)出β-半乳糖苷酶活性（α互補(bǔ)）。
pUC-T TA載體以pUC18載體為基礎(chǔ)構(gòu)建而成，因此，適合pUC18載體的感受態(tài)細(xì)胞都可以使用。推薦使用本公司YJ0807 *0感受態(tài)細(xì)胞、YJ0808 DH5α感受態(tài)細(xì)胞。
4．陽性克隆篩選
陽性DNA片段成功插入至pUC-T Vector中后，一般情況下β-半乳糖苷酶的表達(dá)將受
到破壞，重組克隆體在含有X-Gal、IPTG、Amp的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)將顯示白
色菌落。但有時(shí)比較短的DNA片段插入載體時(shí)，基因的讀碼框有可能正好與LacZ的
讀碼框相吻合，克隆體也會(huì)顯示藍(lán)色菌落。
5．陽性對(duì)照
為了確認(rèn)實(shí)驗(yàn)操作的正確性，以及實(shí)驗(yàn)試劑的有效性，我們建議使用本試劑盒中配
備的Control Insert（750 bp）進(jìn)行陽性對(duì)照實(shí)驗(yàn)。
使用方法
1．按以下體系配制反應(yīng)液：
成分 反應(yīng)體系 對(duì)照體系
pUC-T 1 μl 1 μl
DNA插入片段 * 0.1 -0.3 pmol --
Control Insert DNA -- 1 μl
2×Quick Ligation Reaction Buffer 5 μl 5 μl
Quick T4 DNA Ligase 1 μl 1 μl
RNase-Free Water 補(bǔ)足至 10 μl 補(bǔ)足至 10 μl
*Insert DNA的使用量：在進(jìn)行克隆時(shí)，Vector DNA和Insert DNA的摩爾比一般為：1:2-1:10，
可根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況選擇適當(dāng)?shù)腣ector DNA和Insert DNA的摩爾數(shù)比。Insert DNA的使用量=nmol數(shù)×660×Insert DNA bp數(shù)。本載體1 ml（50 ng）的摩爾數(shù)約為0.03 pmol。
2．輕輕混合，短暫離心。25℃反應(yīng)5分鐘。
注意：反應(yīng)時(shí)間不要超過15分鐘，否則會(huì)降低連接效率。
3．反應(yīng)結(jié)束后，將DNA連接產(chǎn)物存放于0-4℃，而后進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)；也可將 DNA連接
產(chǎn)物置于-20℃保存。
注意：勿進(jìn)行加熱失活反應(yīng)。
4．將連接產(chǎn)物加入50 μl感受態(tài)細(xì)胞中（將感受態(tài)細(xì)胞置于冰上融化），冰浴30分鐘。
注意：用化學(xué)法轉(zhuǎn)化時(shí)，連接產(chǎn)物的加入量不要超過感受態(tài)細(xì)胞體積的10%。
5．42℃熱擊45秒鐘，迅速將離心管轉(zhuǎn)移到冰浴中，冰上靜置2-3分鐘。
6．加入450 μl無菌SOC或LB培養(yǎng)基，混勻后置于37℃搖床，150 rpm振蕩培養(yǎng)45分鐘，
使菌體復(fù)蘇。
7．根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，取適量已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞，加到含有X-Gal、IPTG和Amp的LB固體
培養(yǎng)基上，用無菌的涂布棒將細(xì)胞均勻涂開，將平板置于37℃，直至液體被吸收后，
倒置培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)12-16小時(shí)。
8．計(jì)算白、藍(lán)色菌落，挑選白色菌落，使用PCR法或酶切法鑒定插入片段是否正確。
