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碳酸酐酶（Carbonic Anhydrase ，CA）試劑盒說明書 |
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碳酸酐酶（Carbonic Anhydrase ，CA）試劑盒說明書 微量法 100 管/96 樣 正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定 測定意義： 碳酸酐酶(CarbonicAnhydrase ，CA)是一種含鋅金屬酶，迄今在哺乳動物體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)至少有 11種同工酶，它們的結(jié)構(gòu)、分布、性質(zhì)各異， 多與各種上皮細胞泌H-和碳酸氫鹽有關(guān)，通 過催化CO2水化反應(yīng)及某些脂、醛類水化反應(yīng)， 參與多種離子交換 ，維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。 測定原理： 碳酸酐酶具有酯酶活性， 可催化乙酸對硝基苯酯反應(yīng)生成對硝基苯酚， 通過檢測 405nm 處 吸光值上升速率反映碳酸酐酶活性。 需自備的儀器和用品： 酶標儀、水浴鍋、可調(diào)式移液器、 96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。 試劑的組成和配制： 提取液：液體 50mL×2 瓶， 4℃保存； 試劑一：液體 20mL×1 瓶， 4℃保存； 試劑二： 粉劑×1 瓶， -20℃避光保存； 臨用前加入 5mL 試劑三，充分溶解待用， 用不完的 試劑繼續(xù)-20℃避光保存。 試劑三：液體 6mL×1 瓶， 4℃保存。 樣品測定的準備： 1、細菌或細胞的處理：收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量 （104 個）： 提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細菌或細胞加入 1mL 提取液）， 超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3S，間隔 10S，重復(fù) 30 次） ；8000g ，4℃離心 10min，取上清， 置冰上待測。 2、組織的處理：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液） ，冰浴中勻漿。 8000g ，4℃離心 10min，取上清， 置冰上待測。 測定步驟 1 、酶標儀預(yù)熱 30min，調(diào)節(jié)波長至 405nm。 2 、試劑一、試劑二提前 25℃預(yù)熱 10min。 3 、取 96 孔板，依次加入 20μL 樣本上清， 140μL 試劑一， 最后加入 40μL 試劑二。立刻混 勻， 測定 405nm 下 3min 處吸光值 A1 與 6min 處吸光值 A2 ，ΔA=A2-A1 CA 活力計算： 標準條件下測定回歸方程為 y = 1.0424x + 0.001，R2 = 0.9994；x 為標準品濃度（μmol/mL）， y 為吸光值。 1、按照蛋白濃度計算 單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 對硝基酚定義為一個酶活力單位。 CA 活性(nmol/min/mg prot)=(ΔA-0.001) ÷1.0424×V 樣÷(V 樣×Cpr)÷T×1000 =319.77×(ΔA-0.001) ÷Cpr 2、按樣本鮮重計算 單位的定義：每 g 組織每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 對硝基酚定義為一個酶活力單位。 CA 活性(nmol/min/g 鮮重)=(ΔA-0.001) ÷1.0424×V 樣÷(W ×V 樣÷V 樣總)÷T×1000 =319.77×(ΔA-0.001) ÷W 3、按細菌或細胞密度計算 單位的定義： 每 1 萬個細菌或細胞每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 對硝基酚定義為一個酶活力單位。 CA 活性(nmol/min/104 cell)=(ΔA-0.001) ÷1.0424×V 樣÷(500 ×V 樣÷V 樣總)÷T×1000 =0.639×(ΔA-0.001) V 樣： 加入樣本體積： 0.02mL；V 樣總： 加入提取液體積， 1 mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度， mg/mL；W：樣本質(zhì)量， g；500：細菌或細胞總數(shù)， 500 萬； T：反應(yīng)時間， 3min；1000，μmol 到nmol 的換算系數(shù)。 從2011年開始我們致力于在生命科學領(lǐng)域、生物醫(yī)學實驗外包及論文潤色服務(wù)，協(xié)助客戶各類實驗服務(wù)及論文潤色十余年，是客戶您值得信賴的科研合作伙伴! 如果您受時間、試驗條件等限制而無法完成您的課題研究，歡迎您與我們聯(lián)系。
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