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β-葡萄糖苷酶（β-GC)活性檢測試劑盒說明書 |
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β-葡萄糖苷酶（β-GC)活性檢測試劑盒說明書 注意：正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定 規(guī)格：100T/48S 產(chǎn)品內(nèi)容： 提取液：液體 100mL×1 瓶，4℃保存。 微量法 試劑一：粉劑×1 瓶，-20℃保存；臨用前每瓶加入 12mL 雙蒸水，充分溶解備用；用不完的試劑仍-20℃保存。 試劑二：液體 15mL×1 瓶，4℃保存。試劑三：液體 15mL×1 瓶，4℃保存。 標準品：液體 1mL×1 支，5μmol/mL 的對硝基苯酚溶液。 產(chǎn)品說明： β-GC（EC 3.2.1.21）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中，催化β-糖苷鍵水解，具有多方面生理作用：在纖維素的糖化作用中，β-GC 負責進一步水解纖維素二糖和纖維素寡糖生成葡萄糖；β-GC 水解萜烯類香氣前驅(qū)體，使糖苷鍵合態(tài)變成游離態(tài)。從而產(chǎn)生香味；β-GC 能夠水解植物體內(nèi)野黑櫻苷，釋放 HCN，從而防止昆蟲取食。 β-GC 分解對-硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷生成對-硝基苯酚，后者在 400nm 有最大吸收峰，通過測定吸光值升高速率來計算β-GC 活性。 試驗中所需的儀器和試劑： 可見分光光度計/酶標儀、臺式離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量玻璃比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水 操作步驟： 一、粗酶液提取： 1、細菌或培養(yǎng)細胞的處理：收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照每 1000 萬細菌或細胞加入 1mL 提取液，超聲波破碎細菌或細胞（功率 20％，超聲 3s，間隔 10s，重復 30 次），15000g， 4℃，離心 20min，取上清，置冰上待測。 2、組織的處理：稱取約 0.2g 組織，加入 1mL 提取液進行冰浴勻漿；15000g，4℃，離心 20min，取上清，置冰上待測。 3、標準樣品的準備：取 100μL 標準液，加入到 400μL 試劑三中，得到 1μmol/mL 標準液，十倍稀釋到 100nmol/mL，用蒸餾水倍比稀釋：50、25、12.5、6.25nmol/mL。100、50、25、12.5、6.25、0nmol/mL 做標準液。 二、測定步驟 1.分光光度計或酶標儀預熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 400nm，蒸餾水調(diào)零。 2.加樣表 試劑名稱（μL）測定管對照管標準管 試劑一120 試劑二150150 樣本3030 充分混勻，放入 37℃準確水浴 30min 后，立即放入沸水浴中煮沸 5min（蓋緊，以防止水分散失），流水冷卻后充分混勻（以保證濃度不變） 充分混勻，8000g，4℃，離心 5min，取上清液（在 EP 管或 96 孔板中加入下列試劑） 充分混勻，室溫靜置 2min 后，400nm 處測定吸光值 A，計算ΔA=A 測定管-A 對照管。三、β-GC 活力計算： 1、標準曲線建立：根據(jù)標準管的濃度（y）和吸光度（減去濃度為 0 標準管的 OD 值，x），建立標準曲線。 2、根據(jù)標準曲線，將ΔA（x）帶入公式計算樣品產(chǎn)物濃度（nmol/mL）。 （1）按樣本蛋白濃度計算： 單位的定義：每 mg 組織蛋白每小時產(chǎn)生 1nmol 對-硝基苯酚定義為一個酶活力單位。 β-GC 活力(U/mg prot)=(y×V 反總)÷(V 樣×Cpr)÷T=20×y÷Cpr 需要另外測定，建議使用本公司 BCA 蛋白質(zhì)含量測定試劑盒。 （2）按樣本鮮重計算： 單位的定義：每 g 組織在每小時產(chǎn)生 1nmol 對-硝基苯酚定義為一個酶活力單位。 β-GC 活力(U/g 鮮重) = (y×V 反總)÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T=20×y÷W （3）按細菌或細胞數(shù)量計算： 單位的定義：每 1 萬個細菌或細胞每小時產(chǎn)生 1nmol 對-硝基苯酚定義為一個酶活力單位。 β-GC 活力(U/104 cell)=(y×V 反總)÷(1000×V 樣÷V 樣總)÷T=0.02×y Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；V 反總：反應體系總體積，0.3mL；V 樣：加入反應體系中樣本體積，0.03mL；V 樣總：加入提取液體積，1mL；W：樣品鮮重，g；1000：細胞或細菌總數(shù)，1000 萬；T：反應時間，0.5h。 從2011年開始我們致力于在生命科學領(lǐng)域、生物醫(yī)學實驗外包及論文潤色服務，協(xié)助客戶各類實驗服務及論文潤色十余年，是客戶您值得信賴的科研合作伙伴! 如果您受時間、試驗條件等限制而無法完成您的課題研究，歡迎您與我們聯(lián)系。
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